尊敬的师弟，最近在载体构建方面进展如何？我有个消息想和你分享，我昨天的载体成功长出了单克隆，但遗憾的是菌落P全是空载！请问你是采用哪种方法进行载体构建的？是无缝克隆还是重组酶克隆？这两者之间有哪些区别？我想，无缝克隆不就是重组酶重组吗？

在实验室中，相信大家都经历过载体构建的挑战，并且常常会碰到单菌落挑取时没有条带的困扰。在众多生长的单菌落中，阳性率为何如此之低呢？在回答这个问题之前，我们需要先明确无缝克隆和重组酶克隆的实验原理是否一致。

无缝克隆的原理

无缝克隆的核心是采用Gibson组装法，它能实现DNA片段的体外组装。该方法是由Daniel G Gibson及其团队于2009年开发的，依赖三种酶的协同作用来实现无痕克隆。具体来说，T5核酸外切酶会从DNA片段的5'端开始切割，生成单链的3'黏性末端。这一过程将揭示互补序列，使相邻片段的同源区域能够配对并退火。随后，DNA聚合酶会利用互补链进行填补，修复T5外切酶产生的缺口，最终DNA连接酶封闭剩余的缺口，从而形成完整的双链结构。

然而，无缝克隆的局限性也不可忽视。T5核酸外切酶的反应时间过长或酶量过多可能导致同源臂被过度切割，从而增加脱靶的风险；DNA聚合酶在修复过程中也可能引入错配碱基，导致测序错误，或在不理想的反应条件下，未能完全填补造成连接失败。此外，即使载体经过线性化处理，如果末端是平末端，连接酶仍有可能催化载体自连，从而进一步降低阳性率。这就是为什么虽然单菌落数量众多，但阳性率却偏低的原因。

重组酶同源重组的优势

相较于无缝克隆，重组酶同源重组作为一种常规的载体构建手段，能够有效降低假阳性的现象。早期研究发现，细菌粗提取物能够介导DNA片段的同源重组。这些提取物中含有关键的RecA重组酶和Tn5转座酶，前者是细菌内源性同源重组系统的核心酶，后者则可能在重组中产生DNA断裂，促进RecA依赖的修复。基于这些酶的协同效应，尊龙凯时团队开发了重组酶克隆CloneUFO®，以确保较高的克隆阳性率。

重组酶同源重组的基本原理在于，将目的DNA片段的两端引入与载体DNA片段相同的特定序列，从而在重组酶的作用下实现同源片段间的交换。此过程中不需要连接酶参与，同源片段直接进行替换，这样可以实现高特异性的重组。

具体操作以尊龙凯时CloneUFO® OneStep Cloning Kit为例，流程包括：首先通过限制内切酶或反向PCR线性化载体，确保完整线性化以减少假阳性；其次设计引物在目的片段两端引入与载体末端匹配的同源臂，通过高保真PCR进行扩增；然后，与插入片段按比例混合后加入重组酶与缓冲液，反应30分钟；最后，将重组产物转化至感受态细胞，并通过抗生素抗性、菌落PCR或测序验证阳性克隆。

总结

重组酶依赖的同源重组在分子生物学中的应用应得到了重视，与传统的酶切克隆和无缝克隆相比，其具有诸多优点：支持长同源臂匹配，减少非特异性重组风险，适用于较大插入片段，重组酶完成完整的重组反应，不会造成缺刻等。这使得重组酶同源重组在基因功能研究和分子克隆中展现出其独特的优势。

尊龙凯时的重组克隆试剂盒凭借其高精确性和广泛适用性，为科学研究提供了强有力的工具，助力科研人员在基因研究与应用领域取得更大突破。