细胞裂解液的制备

一、试剂准备

1. 新鲜配制的冷RIPA裂解缓冲液：
     - 150mM NaCl
     - 1% NP-40 (去垢剂)
     - 0.1% SDS (去垢剂)
     - 2μg/ml Aprotinin (蛋白酶抑制剂，使用前加入)
     - 2μg/ml Leupeptin (蛋白酶抑制剂，使用前加入)
     - 1mM PMSF (蛋白酶抑制剂)
     - 15mM EDTA (蛋白酶抑制剂)
     - 1mM Na Vanadate (磷酸脂酶抑制剂，任选)
所有试剂均按比例溶解于150mM NaCl溶液中。

2. 冷PBS中加入1mM PMSF、15mM EDTA及1mM Na Vanadate（钒酸钠，可选）。

3. 选择生长状态良好的对数期细胞，使用75cm²培养瓶至少3-4瓶（区域生长面积超过90%）。

二、实验步骤

1. 将培养瓶放置在冰上，用吸液管吸出培养基。用足够的冷PBS对细胞表面进行充分洗涤，以去除残留的培养基，重复此过程2-3遍。在最后一次洗涤时，尽量吸干残留的PBS，并保持在冰上操作。

2. 向培养瓶中加入冷RIPA裂解缓冲液（每个75cm²培养瓶加1ml），然后用细胞刮子沿瓶壁刮取细胞。如果需要刮取多瓶同种细胞，第一瓶中的细胞液可转移至下一瓶中继续刮取（由于裂解液较粘稠，建议使用直径较大的吸液管吸取）。

3. 将刮取的细胞裂解液移入14ml的离心管中（保持在冰上），然后重复步骤2以获取剩余细胞。

4. 尽量将更多的细胞裂解液收集至14ml离心管中，并将样品放入冰盒中进行超声处理，超声强度以不产生泡沫为准，每次超声2-3秒，重复3-4次。如仍有细胞碎片或沉淀，需以10000rpm离心10分钟，留取上清液。

5. 取出少量细胞裂解液测量其蛋白浓度（可使用Biorad Bradford试剂盒或紫外分光光度计，测定A280），分装并保存在-70℃冷冻。细胞裂解通常可以通过物理或化学方法实现。

物理方法

1. 反复冻融：将细胞置于-20℃和25-30℃环境中反复冻融10至20次，适用于大多数哺乳动物细胞。
2. 煮沸法：将细胞置于100℃沸水中煮沸5-10分钟，适用于大部分微生物细胞。
3. 超声法：使用超声破碎仪，以一定频率破碎细胞，适用于绝大多数微生物细胞。
4. 渗透压法：将膜较薄的细胞放置于纯水等低渗溶液中，促进细胞吸水破裂。
5. 液氮法：植物细胞通常采用液氮捻磨的方法进行破裂。

化学方法

1. 强酸、强碱溶液：一般使用0.5N NaOH溶液可裂解绝大部分动物细胞和微生物细胞。
2. 生物酶：常用溶菌酶、蛋白酶K等酶裂解微生物细胞。