## 类器官原代培养流程

### 一、准备工作

1. **仪器设备**：CO2培养箱、双人单面超净台、倒置显微镜、台式冷冻离心机、水浴锅、医用冰箱、-80℃冰箱、移液器（套装）、眼科剪、眼科镊。

2. **试剂耗材（以肠癌为例）**：动物脑类器官培养基试剂盒、基质胶（低因子、无酚红）、60mm细胞培养皿、100μm滤筛、15mL离心管、15mLEP管若干、24孔细胞培养板、金属冰盒、眼科剪刀、眼科镊。

试剂组件：动物脑类器官培养基A（100mL）、原代培养缓冲液B（250mL）、原代组织消化液C（30mL）、类器官传代消化液D（30mL）、组织保存液E（100mL）、类器官冻存液F（20mL）、类器官传代培养缓冲液G（250mL）。

### 二、操作流程

1. **样本准备**：将组织放入含有预冷的组织保存液E的取样瓶中，静置4℃转运至实验室。取出组织后放入培养皿，记录相关信息，如大小、颜色、软硬程度、组织类型等。

2. **清洗与剪碎**：在60mm细胞培养皿中加入原代培养缓冲液B，清洗三次后剪碎组织，并转移至15mL离心管。

3. **消化与过滤**：向离心管中加入消化液C进行消化，观察消化情况后，终止消化并用缓冲液B稀释，使用滤筛过滤，收集滤液并进行离心。

4. **加胶、点板与加液注入**（此步骤非常关键）：
- 准备基质胶并预冷其他耗材。
- 接种时每孔添加25μL基质胶和500-750μL培养介质，确保在低温环境下操作，以维持基质胶的流动性。
- 在培养箱中静置使基质胶固化，再添加培养基进行培养，通常定期查看细胞生长情况。

### 三、传代操作步骤

对于类器官较多或较大的情况，首先收集并洗涤类器官，然后进行消化，终止消化后操作同样为加入基质胶与培养液。若类器官数量不足，则需等比例集中入孔中。确保在离心与添加基质胶的各个步骤中，使用的设备与试剂均为预热或预冷至合适温度。

### 四、冻存与复苏

类器官在指数生长期时进行冻存，通常传代后的第3至4天进行处理。冻存时可使用DMSO作为保护液，逐步进行梯度冷冻，以确保类器官的活性与完整性。在复苏过程中，务必快速进行，并在条件允许的情况下，尽量使用洁净的超净台操作。

### 五、总结

在整个实验流程中，选择合适的设备与试剂，以及严格遵循操作规范，能够显著提高类器官的培养与操作成功率。在此过程中，**尊龙凯时**品牌的相关产品可为您提供优质的材料与设备支持，帮助您实现成功的科学实验。

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